Chapter 27: Laboratory Hematology

（第27章:檢驗血液學）

口試委員視角重點整理。聚焦於各項檢驗的原理、適應症、判讀陷阱與常見假影(artifact),供血液科專科口試準備使用。

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一、檢體與檢驗前變異(Preanalytical Basics)

1. 血液學與凝血檢查最常用哪些採血管?為什麼不能混用?

   • 紫頭管(EDTA):經由 calcium chelation 抗凝,不稀釋檢體,是 CBC 與 WBC differential 的標準管。
   • 淺藍頭管(sodium citrate,3.2% 或 3.8%):用於 PT、aPTT、fibrinogen、D-dimer、anti-Xa 等凝血檢查;citrate 濃度必須配合抽血量(標準比例為 blood:citrate = 9:1),且 3.2% 與 3.8% 不可互換,因鈣離子螯合程度不同會影響凝血時間。
   • 紅頭管(無添加物,凝固後測血清):不可用於凝血檢查,因血清凝固過程已消耗 fibrinogen 並改變其他凝血因子。
   • 綠頭管(heparin):經由 thrombin inhibition 抗凝,適合急件生化,但因抑制 thrombin,同樣不可用於凝血檢查。
   • 黃頭管(ACD):用於需要細胞存活的特殊檢驗(如輸血庫細胞保存、HLA typing)。

2. EDTA 引起的 pseudothrombocytopenia 該如何確認與矯正?

   • 懷疑機轉為 EDTA 誘發之體外血小板聚集(agglutination),導致自動分析儀低估血小板數。
   • 確認方式:觀察血片是否有血小板聚集(clumping);改用 sodium citrate 管重新採血通常可解決此假影,但須經實驗室驗證。
   • 因 citrate 管稀釋檢體,換算回 EDTA 對應值時,結果須以 10% 校正係數換算(因 citrate 稀釋而 EDTA 不稀釋)。

3. 紅血球比容(Hct)過高或過低,對 PT/aPTT 有什麼影響?為何?

   • Polycythemia(Hct > 55%)且未依比例調整 citrate 抗凝劑用量時,血漿中 citrate 相對濃度過高,導致 recalcification 不完全,造成 PT、aPTT 假性延長(artifactual prolongation)。
   • 對於 Hct > 55% 的病人,須依指引調整藍頭管的 citrate 體積;貧血病人則不需調整。

4. 溶血(hemolysis)、黃疸(icterus)、脂血(lipemia)(HIL)對凝血檢查有何影響?

   • HIL 造成背景吸光度升高,干擾光學比濁法(light-scattering)偵測凝血終點,可能影響結果準確性。
   • 體外溶血常因採血技巧不當;體內溶血則可能反映真實病理(如 AIHA、TMA、DIC),須留意兩者鑑別。
   • 即使儀器聲稱不受 HIL 影響,仍應留意 HIL 本身可能反映或促進凝血活化,須質疑檢體品質。

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二、自動化血球計數與紅血球分析(Automated CBC & Erythrocyte Analysis)

1. 自動血球分析儀計數與分類血球的原理有哪幾種?

   • Aperture impedance(電阻抗法):細胞通過帶電解質溶液的窄孔時造成電流/電壓脈衝改變,脈衝大小反映細胞體積。
   • Optical absorbance:利用細胞內酵素(如 peroxidase)吸光反應辨識特定細胞(如中性球、嗜酸性球),並與淋巴球區分。
   • Optical light scatter(類似 flow cytometry):forward scatter(FS)反映細胞大小,side scatter(SS)反映內部複雜度(顆粒性),藉此分出淋巴球(SS、FS 皆低)、單核球(SS、FS 中等)、中性球(SS 稍高)三大族群。
   • Fluorescence(螢光染劑/標記抗體):用於更精細地區分血小板、網狀紅血球、胎兒紅血球、NRBC、嗜中性球、淋巴球、芽細胞。

2. WBC 計數在什麼情況下會假性升高或假性偏低?

   • 假性升高:hyperleukocytosis 或巨大血小板(giant platelets)因體積與紅血球相近,被誤計為 WBC(impedance 法)。
   • 假性偏低:agglutination(多顆細胞被當成單一顆計數)或 in vitro hemolysis。

3. 哪些因素會造成 Hgb 測定不準確?MCV 為何會假性升高?

   • Hgb 測定原理:溶解 Hgb 與試劑(potassium ferricyanide、imidazole 或 sodium lauryl sulfate)結合後以分光光度計測吸光值;凡影響「濁度」的因子(白血球增多症、高脂血症、高膽紅素血症)均可能使 Hgb 假性偏高。
   • MCV 由 RBC volume distribution 推算,可能因 RBC agglutination、高血糖(hyperglycemia,細胞在等滲液中吸水腫脹)或白血球增多症而假性升高。
   • RDW 反映紅血球體積變異度(anisocytosis)。

4. 網狀紅血球(reticulocyte)相關的進階參數有哪些?臨床用途為何?

   • Ret-He(reticulocyte hemoglobin equivalent,Sysmex XN)、CHr/MCVr/CHCMr(Advia)、CHCr/MCHr(Cell-Dyn、Alinity)等,皆用於評估網狀紅血球的血紅素含量。
   • 臨床用途:早期偵測缺鐵性貧血、監測透析病人對鐵劑治療的反應。
   • Immature reticulocyte fraction(IRF)可輔助評估骨髓造血活性(如移植後造血恢復)。

5. 周邊血液出現 NRBC 代表什麼意義?

   • 新生兒出現 NRBC 屬正常現象;但超過此時期出現 NRBC 即屬異常,常與造血壓力或骨髓結構破壞有關,如溶血性貧血、骨髓增生性腫瘤、轉移癌侵犯骨髓、缺氧等。
   • 現代分析儀可自動偵測並校正 WBC 及淋巴球計數,排除 NRBC 造成的干擾。

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三、周邊血液抹片與紅血球形態異常(Peripheral Smear & Poikilocytosis)

1. 周邊血液抹片檢視的標準流程為何?

   • 低倍鏡(×10)先掃描全片,尋找血小板凝集或位於抹片側緣/前緣的大型異常細胞(如芽細胞)。
   • 高倍鏡(×50、×100)於抹片較厚部位與前緣交界處(紅血球呈現中央淡染且幾乎不重疊處)進行細胞型態與白血球分類判讀。

2. 哪些紅血球形態變化是口試常考的「一眼辨識」重點?請說出其致病機轉與相關疾病。

形態異常	機轉	相關疾病
Schistocytes(helmet cells)	微血管內纖維絲/血小板血栓機械性切割	MAHA:TTP、HUS、DIC、移植相關TMA、機械性心瓣膜、嚴重燒傷
Spherocytes	細胞膜表面積減少	遺傳性球形紅血球增多症(HS)、自體免疫溶血性貧血
Sickle cells(drepanocyte)	HbS 分子聚合	鐮刀型血球疾病(非 trait)
Target cells(codocyte)	細胞膜相對過剩、常呈 hypochromic	肝病、脾切除後、地中海貧血、HbC disease
Teardrop cells(dacrocyte)	骨髓纖維化/肉芽腫/腫瘤浸潤造成擠壓變形	骨髓纖維化、骨髓性癆貧血(myelophthisic anemia)
Bite cells(degmacyte)	脾臟「咬除」Heinz body	G6PD 缺乏症、藥物誘發氧化性溶血
Acanthocytes(spur cells)	膜脂質組成改變	肝病、無β脂蛋白血症、脾切除後
Burr cells(echinocytes)	膜脂質異常;常為人為假影	多為 artifact,也見於尿毒症
Howell-Jolly bodies	核 DNA 殘留	脾切除後、急性溶血性貧血、巨球性貧血
Basophilic stippling	核糖體沉澱	鉛中毒、地中海貧血、pyrimidine-5’-nucleotidase 缺乏
Pappenheimer bodies	含鐵之 siderosome 或粒線體殘留	鐵母細胞性貧血、鐵過載
Cabot rings	核殘留物	脾切除後、急性溶血性貧血、巨球性貧血
Ovalocyte(elliptocyte)	細胞骨架蛋白異常	遺傳性橢圓形紅血球增多症
Stomatocytes	膜陽離子通透性缺陷	遺傳性口型紅血球增多症;也常為抹片風乾人為假影(須以濕式抹片確認)

3. ICSH 對 schistocytes 報告的建議標準為何?

   • 建議 schistocytes 超過紅血球總數 1% 時應予報告,以輔助評估 thrombotic microangiopathy;但實際報告門檻應由各實驗室自行驗證。

4. Stomatocytes 在判讀上最容易犯的錯誤是什麼?

   • 抹片風乾(air-drying)過程本身就可能人為產生類似 stomatocyte 的形態;因此若懷疑真正的遺傳性口型紅血球增多症,須以「濕式抹片(wet preparation)」的新鮮血液確認,而非僅憑一般風乾抹片判斷。

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四、白血球分類與血小板分析(Leukocyte Differential & Platelet Analysis)

1. 手動白血球分類的主要限制為何?數位影像技術如何改善?

   • 手動分類樣本量小(通常僅 100–200 顆細胞),易受抽樣偏差與判讀者間差異影響。
   • 數位顯微鏡(如 CellaVision DM9600、Scopio X100)可自動掃描、預先分類 WBC 影像供人員確認,提升準確度並減少人工時間;部分機型(如 Roche cobas m511)可直接將血液印製上玻片、染色、產生細胞影像供判讀。

2. 血小板計數容易受到哪些假影干擾?造成計數偏高或偏低的原因分別是什麼?

   • 偏高(假性血小板增多):巨大紅血球碎片、cryoglobulin、microcytic RBC 被誤計為血小板。
   • 偏低(假性血小板減少,pseudothrombocytopenia):EDTA 誘發之血小板聚集(clumping)、giant platelets 被誤計為 RBC。
   • Mean platelet volume(MPV)會隨 EDTA 暴露時間產生變化,須快速上機分析,且須配合臨床判讀,不可單獨用於區分血小板破壞 vs. 生成不足。

3. Immature platelet fraction(IPF)的臨床用途為何?

   • 利用 RNA 結合螢光染劑分析血小板體積與螢光強度計算而得。
   • 可協助鑑別「骨髓造血衰竭」與「周邊破壞」導致的血小板低下,並可用於監測幹細胞移植後骨髓恢復或 thrombopoietin-mimetic 藥物治療反應。

4. Supravital stains 在紅血球內含物偵測上分別偵測什麼?

   • Crystal violet:偵測變性血紅素內含物(Heinz bodies),見於 G6PD 缺乏等酵素病變。
   • Brilliant cresyl blue:沉澱並偵測不穩定血紅素(如 α-thalassemia 的 HbH inclusion)。

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五、骨髓抽吸與切片、特殊染色(Bone Marrow Aspirate/Biopsy & Special Stains)

1. 骨髓檢查的常見適應症有哪些?

   • 不明原因血球減少症、不明原因白血球增多(疑似急性白血病)、紅血球增多症或血小板增多症、淋巴瘤分期、漿細胞腫瘤診斷、鐵儲存評估、感染評估、以及不明原因脾腫大。

2. 骨髓抽吸與切片的標準採檢部位在哪?嬰兒有何不同?

   • 成人最常自後髂骨脊(posterior iliac crest)採檢;新生兒與幼嬰則常自前脛骨(anterior tibia)取得抽吸檢體。
   • 高品質抹片需採到足夠的骨髓小粒(spicule),spicule 周圍區域是最具代表性的判讀部位。

3. 骨髓檢體如何分配給不同的輔助檢查(flow cytometry、cytogenetics、molecular)?各自建議的抗凝劑為何?

   • 骨髓抽吸檢體通常以 EDTA 收集供 flow cytometry 及分子檢測用;細胞遺傳學檢查則建議以 heparin 收集。
   • Formalin 固定石蠟包埋(FFPE)的骨髓切片或凝固之骨髓抽吸檢體可另作組織學、免疫組織化學染色;凝固骨髓抽吸的 FFPE 檢體亦可用於 FISH 或分子檢測,但去鈣化(decalcified)骨髓切片的核酸品質較差,不利分子檢測。
   • 若無法抽吸(dry tap),可將骨髓切片解聚(disaggregate)以取得新鮮組織進行需要新鮮檢體的輔助檢查。

4. 請說明下列常用特殊染色的染色目標與臨床意義:MPO、Leder(NASDCE)、nonspecific esterase、TdT、PAS、Iron stain。

   • Myeloperoxidase(MPO):染中性球初級顆粒與嗜酸性球次級顆粒;成熟淋巴球不染色。
   • Naphthol AS-D chloroacetate esterase(specific esterase,Leder stain):中性球與肥大細胞染色,淋巴球與單核球不染。
   • α-Naphthyl butyrate 或 α-naphthyl acetate(nonspecific esterase):染單核球、巨噬細胞、組織細胞;不染中性球或嗜酸性球;成熟 T 淋巴球呈點狀(dot-like)染色;巨核細胞以 α-naphthyl acetate 染色,但 α-naphthyl butyrate 不染巨核細胞(重要鑑別點)。
   • TdT(terminal deoxynucleotidyl transferase):核內酵素,染 thymocyte 與 lymphoblast,成熟淋巴球不染;部分骨髓母細胞(myeloblast)亦可陽性。
   • PAS(periodic acid–Schiff):偵測細胞內醣原與中性黏液物質;於急性淋巴性白血病、急性紅血球白血病、Gaucher cell 呈陽性。
   • Iron stain(Perls/Prussian blue):偵測 NRBC 內的 hemosiderin(sideroblastic iron)及組織細胞內的鐵(reticuloendothelial iron)。Ring sideroblast 定義為至少 5 顆藍染鐵顆粒環繞至少 1/3 核周(位於粒線體內)。骨髓切片染鐵可能因去鈣化過程流失鐵而低估鐵儲存,故建議以骨髓抽吸抹片評估鐵儲存。

5. 免疫組織化學(IHC)在骨髓/淋巴組織診斷上有哪些不可取代的角色?

   • 可作為 flow cytometry 的替代或輔助手段,提供形態學與表現型(phenotype)的對照。
   • 可用於未分化腫瘤定性、淋巴增生性疾病與非典型淋巴浸潤的判讀,協助芽細胞計數。
   • 對於無法抽吸(dry tap)的病人,可於切片上進行 IHC。
   • 亦可用於非腫瘤性疾病之病原體特異性染色(如 EBV、CMV)。

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六、流式細胞儀(Flow Cytometry)

1. 流式細胞儀最常見的閘門(gating)策略為何?各族群的 CD45/side scatter 特徵是什麼?

   • 最常用以 side scatter(SS)對 CD45 訊號強度作圖:
     • 淋巴球:CD45 強陽性,SS 低。
     • 單核球:CD45 強陽性,SS 中等。
     • 中性球:CD45 由中等至弱陽性,SS 高。
     • 芽細胞(blasts):SS 低,CD45 弱或陰性(這在淋巴系芽細胞中,CD45 陰性更常見)。

2. 造血分化過程中,各系列的 CD 標記變化大致是如何?(可作為考官追問各系列標記時的骨架)

   • 未分化前驅細胞(uncommitted progenitor):CD34+、CD38-,隨分化承諾(lineage commitment)漸表現 CD38。
   • 骨髓系分化:CFU-GEMM(CD34+、HLA-DR+、CD33-/+)→ CFU-GM(CD34+、HLA-DR+、CD33+、CD13-/+、CD15-/+);中性球前驅細胞漸失 HLA-DR 與部分 CD33,獲得 CD11b、CD16;單核球則保留 HLA-DR、強 CD33,並獲得 CD14、強 CD64。
   • B 細胞分化:前驅細胞表現 TdT、HLA-DR、CD10、CD34;成熟過程中下調 CD34、CD10,表現 surface IgM 及成熟 B 細胞標記(CD20、CD21、CD22、CD79b),並僅表現單一 κ 或 λ 輕鏈(monotypia 是判斷 B 細胞腫瘤的關鍵)。
   • T 細胞分化:前驅細胞先表現 cytoplasmic CD3、CD7,再表現 CD2、CD5;common thymocyte 表現 CD1a、CD4、CD8;成熟 T 細胞表現 CD2、CD3、CD5、CD7,並分化為 CD4(helper)或 CD8(cytotoxic/suppressor)。
   • NK 細胞:表現 CD2、CD7、CD16、CD56,CD57 與 CD8 表現不定,不表現 surface CD3。
   • 紅血球分化:CD71 表現、逐漸失去 CD34、CD33、CD45,glycophorin 表現漸增,CD71 於成熟時消失。
   • 巨核細胞分化:表現 GPIIb(CD41)/GPIIb-IIIa(CD61)並失去 CD34;GPIb(CD42b)於 promegakaryocyte 期表現;GPV(CD42d)隨成熟增加。

3. 流式細胞儀如何協助診斷陣發性夜間血紅素尿症(PNH)?

   • 偵測紅血球上 GPI-anchored 蛋白之缺失,包括 decay accelerating factor(DAF,CD55)、protectin(MIRL,CD59)。
   • 白血球則可用 GPI anchor 結合螢光試劑 FLAER(fluorescent aerolysin,Alexa 488 標記的 aerolysin 變異體)偵測 CD24(顆粒球)或 CD14(單核球)之缺失。

4. 臨床常見 B 細胞腫瘤的免疫表現型有哪些關鍵鑑別點?(舉出考試最愛考的幾組)

   • CLL/SLL:CD5+、CD23+、CD20 弱陽性(dim)、CD200+,surface Ig 弱陽性(常 <5%)。
   • MCL(mantle cell lymphoma):CD5+、CD23-、Cyclin D1 強陽性、CD200-,可與 CLL 鑑別(CD23 及 CD200 為關鍵)。
   • HCL(hairy cell leukemia):CD11c+、CD25+、CD103+、FMC7+,CD5-、CD10-。
   • Burkitt lymphoma:CD10+、BCL2-、高度增生;LCL(large-cell lymphoma)則 BCL2 約 30–40% 陽性。
   • Myeloma:CD20 常陰性,CD138+、CD38 強陽性、CD56+、MUM1+,cyclin D1 約 15–20% 陽性。

5. Hodgkin lymphoma 的 Reed-Sternberg 細胞與 NLPHL 的 LP 細胞在 IHC 上如何鑑別?

   • 典型 Hodgkin lymphoma(CHL)之 RS 細胞:CD45-、CD30+、CD15+、CD20-、PAX5 弱陽性。
   • 結節性淋巴球為主型 Hodgkin lymphoma(NLPHL)之 LP 細胞:CD45+、CD30 可陰可陽、CD15-、CD20+、PAX5+。
   • 此組合是鑑別 CHL 與 NLPHL,以及與 B/T 細胞淋巴瘤鑑別的重要考點。

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七、細胞遺傳學與分子診斷(Cytogenetics & Molecular Diagnostics)

1. 傳統核型分析(conventional cytogenetics)的原理、優點與限制為何?

   • 需將細胞培養以增加分裂指數(mitotic rate),再觀察中期分裂相之染色體條帶(banding pattern)。
   • Clone 的定義:至少 2 顆分裂細胞具有相同的染色體異常。
   • 限制:需要活的分裂細胞(turnaround time 約 4–10 天)、對 <10 Mb 的微小變異偵測力差、判讀高度仰賴技術人員經驗。

2. FISH 與傳統核型分析相比有何優缺點?

   • FISH 使用特異性螢光標記 DNA 探針辨識特定染色體片段,可在未培養(uncultured)的間期細胞上進行,turnaround time 短(rapid FISH 數小時,一般 1–2 天)。
   • 對 <10 Mb 的異常有較佳敏感度,但僅限於探針設計所鎖定的特定區域,無法做全基因組掃描。
   • 對於淋巴系惡性腫瘤,因細胞生長慢、可分析的中期分裂相少,核型分析成功率較低,漿細胞腫瘤更是罕見成功者,此時 FISH(尤其漿細胞富集後)是偵測疾病特異性基因異常的關鍵工具。

3. 染色體微陣列(chromosomal microarray, CMA)可以偵測什麼?不能偵測什麼?

   • 可偵測:全基因組範圍內的 copy number variation 以及 copy-neutral loss of heterozygosity,解析度達 kb 級。
   • 不能偵測:平衡性染色體重排(balanced translocation/inversion),因這類重排不改變 DNA 拷貝數。

4. PCR、digital droplet PCR、NGS、WGS 在血液腫瘤分子診斷中的角色與限制分別是什麼?

   • PCR:turnaround 快(2–5 天),適合單一基因突變偵測(如 BCR::ABL1、JAK2)及疾病監測。
   • Digital droplet PCR:將反應分割成多個獨立小反應,敏感度極高(可達 0.01%),適合微小殘存病灶(MRD)偵測及特定突變(如 c-KIT)監測。
   • NGS(next-generation sequencing):可平行分析多個基因,用於診斷分類、療效預測與風險分層;但周轉時間長(1–2 週,含生物資訊分析與變異註解),且對含大量重複序列的基因(如 FLT-3、CALR)可能因定位演算法問題而漏檢,須搭配 fragment analysis 等其他方法確認。
   • WGS:成本仍偏高,多數實驗室尚難常規使用;已顯示與骨髓腫瘤細胞遺傳學結果有良好相關性,但實驗室由傳統細胞遺傳學轉換至 WGS 的可行性仍待觀察。

5. 體細胞(somatic)變異的分級(tier)系統與生殖細胞(germline)變異分類系統有何不同?

   • 體細胞變異依美國published recommendations分為 Tier I–IV:Tier I 具高度臨床意義、Tier II 具潛在臨床意義、Tier III 意義未明(VUS)、Tier IV 為良性或極可能良性。
   • 生殖細胞變異則分類為:pathogenic、likely pathogenic、variant of uncertain significance、benign 或 likely benign。

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八、其他實驗室檢驗方法(Miscellaneous Methods)

1. ESR(紅血球沉降速率)的原理與臨床應用限制為何?

   • 原理:測量抗凝血在直立試管中因重力與浮力作用下沉降的速率(mm/hr);血漿蛋白(如 fibrinogen、免疫球蛋白)升高會中和 RBC 膜表面電荷,促進紅血球聚集(rouleaux)加速下沉,故 ESR 升高。
   • 巨球性(macrocytosis)紅血球沉降較快;小球性(microcytosis)或鐮刀型紅血球則沉降較慢,會壓低 ESR。
   • 臨床應用有限,主要用於特定風濕免疫疾病的評估,不適合作為無症狀篩檢;隨年齡增加(尤其女性),ESR 正常參考範圍也會升高。
   • 標準手動方法為 modified Westergren method;自動分析儀結果與其相關性良好。

2. 血紅素電泳/層析檢測(Hgb 分型)有哪些方法?判讀上有何限制?

   • 方法包括 alkaline gel electrophoresis、acid gel electrophoresis、isoelectric focusing、high-performance liquid chromatography(HPLC)、capillary electrophoresis。
   • 沒有任何單一方法可以確診並定量「所有」血紅素變異型,因此以某方法篩檢出的異常血紅素,須以另一種原理不同的方法確認(如疑似 HbS 須以 solubility test 確認)。
   • HPLC 與 capillary electrophoresis 高度自動化、量測精準,適合大量檢測 HbS、HbC、HbE 及 β-thalassemia trait(表現為 HbA2 升高伴小球性貧血)。
   • 若須完整定性 α-thalassemia 或部分罕見地中海貧血/血紅素病變,需以 DNA 分析確診,以利遺傳諮詢。

3. G6PD 缺乏症篩檢最容易誤判(僞陰性)的情境是什麼?

   • 篩檢方法為 dye decolorization 或螢光斑點試驗(fluorescent spot test),依賴 NADPH 相關反應。
   • 若在溶血事件發生中或剛結束後檢測,因新生的網狀紅血球酵素活性接近正常,可能出現假陰性,尤其常見於帶有 A- 變異型的非裔美籍男性。
   • 部分實驗室可加驗其他 RBC 酵素(如 pyruvate kinase)作為輔助 panel。

4. 遺傳性紅血球骨骼蛋白疾病(HS、HE、hereditary pyropoikilocytosis)如何以實驗室方法鑑別?

   • Osmotic fragility test:利用球形紅血球在低滲鹽水中更易溶血的特性篩檢 HS;但對輕度或代償性 HS 不敏感,且可能出現假陽性。
   • EMA(eosin-5-maleimide)binding by flow cytometry:偵測 RBC 膜上 EMA 結合減少,對 HS 的診斷準確度優於 osmotic fragility test,是目前較準確的方法。
   • Hereditary elliptocytosis(HE):通常貧血極輕微,osmotic fragility 與 EMA binding 皆正常。
   • Hereditary pyropoikilocytosis:表現嚴重貧血與明顯異形紅血球,EMA binding 明顯下降。

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九、篩檢凝血檢查:PT 與 aPTT(Screening Coagulation Tests)

1. PT 與 aPTT 分別測量凝血瀑布的哪個部分?兩者共同測量哪些凝血因子?

   • PT(prothrombin time):加入 thromboplastin 試劑與 CaCl₂ 於 citrated plasma,測量外源性路徑(extrinsic pathway,factor VII)及共同路徑(common pathway:factor X、V、II、fibrinogen)。PT 主要評估 4 個維生素 K 依賴因子中的 3 個(II、VII、X;factor IX 屬 aPTT 評估範圍)。
   • aPTT(activated partial thromboplastin time):以負電荷表面活化劑活化接觸因子(contact factors:factor XII、prekallikrein[PK]、high-molecular-weight kininogen[HMWK])及 factor XI,加入 CaCl₂ 活化 factor IX 後測量內源性路徑(intrinsic pathway)及共同路徑。
   • 兩者共同測量的是共同路徑因子:factor X、factor V、prothrombin(II)、fibrinogen。

2. INR 的設計目的與適用範圍為何?常見誤用情境是什麼?

   • INR = (病人 PT / 正常人群 PT 幾何平均值)的 ISI(international sensitivity index)次方,目的在校正不同 thromboplastin 試劑對 warfarin 效應敏感度不一致的問題。
   • INR 專為監測「已穩定使用 warfarin」病人所設計,並非設計用於評估肝病凝血病變或 DOAC 的效應——這是口試常考的觀念陷阱。

3. 單獨 PT 延長(isolated prolonged PT)的鑑別診斷架構為何?

   • 依序考慮:檢驗前變異因素 → 先天性因子缺乏(主要為 factor VII,因其他共同路徑因子缺乏會同時延長 aPTT)→ 後天性抑制物 → 抗凝血藥物(如 warfarin 早期效應)。
   • 標準流程:先做 PT mixing study。若矯正(corrected)→ 做 factor VII 特異性檢測;若未矯正(not corrected)→ 做 lupus anticoagulant(LAC)檢測,陽性則為 LAC,陰性則考慮做 factor VII inhibitor assay。
   • 先天性 factor V、X、II、fibrinogen 缺乏極罕見(約百萬分之一至兩百萬分之一);純合子 factor VII 缺乏盛行率可達約三十萬分之一;dysfibrinogenemia 有時可造成 PT 延長而 aPTT 正常;factor VII 抑制性自體抗體極罕見。

4. 單獨 aPTT 延長(isolated prolonged aPTT)的鑑別診斷架構及重要陷阱為何?

   • 標準流程:先做 aPTT mixing study。
     • 矯正(corrected)→ 檢測 factor VIII、IX、XI 活性;若皆正常,再檢測 factor XII、PK、HMWK 活性。
     • 未矯正(not corrected)→ 做 LAC 檢測;陽性為 LAC,陰性則考慮特定凝血因子抑制物(針對 VIII、IX、XI 做 inhibitor assay)。
   • 重要陷阱:factor XII、PK、HMWK 嚴重缺乏雖可使 aPTT 顯著延長(常 >100 秒),但臨床上不會造成出血傾向,不可誤判為出血性疾病。
   • Hemophilia A(factor VIII 缺乏)與 hemophilia B(factor IX 缺乏)為 X 性聯遺傳,常在幼年因自發性出血或陽性母系家族史被診斷,但輕度血友病(factor VIII/IX 活性 5–40 IU/dL)可能延遲至成年才診斷。
   • Factor XI 缺乏常見於 Ashkenazi 猶太族群,其出血風險與因子缺乏嚴重度相關性差,是另一個常考的觀念陷阱。
   • Type 1 VWD 若 factor VIII 偏低(因 VWF 對 factor VIII 有穩定作用)可能有輕度 aPTT 延長;type 2N、type 3 VWD 則 factor VIII 下降更明顯,aPTT 延長也更顯著。

5. DOAC 對 PT、aPTT 及其他凝血檢查有何干擾?(考官愛問的表格重點)

   • Dabigatran(factor IIa inhibitor):使 PT、aPTT 延長,thrombin time(TT)顯著延長(可作敏感篩檢),antithrombin anti-IIa method 呈 + bias,fibrinogen(Clauss)可能因方法而呈 − bias。
   • Rivaroxaban、apixaban 等 factor Xa inhibitors:使 PT、aPTT 延長(程度依藥物濃度而異),TT 通常不受影響,chromogenic anti-Xa 監測需以特定藥物校正才能定量。
   • 兩類藥物皆可能使 LAC 檢測呈假陽性(誤判為 LAC)、使 PT-based 及 aPTT-based factor 活性檢測呈現「抑制物型態(inhibitor pattern)」的假象、並使 protein C、protein S clotting assay 呈 + bias(可能漏診 protein C/S 缺乏)。
   • 部分實驗室可用活性碳吸附或濾過技術移除血漿中的 DOAC,以減少干擾。

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十、混合試驗與合併異常(Mixing Studies & Combined PT/aPTT Prolongation)

1. Mixing study 的原理與操作方式為何?

   • 以病人血漿與 pooled normal plasma(PNP)以 1:1 混合後重測 PT 或 aPTT。
   • 若為單純凝血因子缺乏,混合後應可提供充分矯正(因混合後因子濃度已達正常下限以上);若為抑制物(inhibitor)存在,則延長時間不會被充分矯正。
   • 需注意:factor VIII 抑制物常為「延遲反應型(delayed-acting)」,須將 1:1 混合物於 37°C 培養 1–2 小時後再測,以免漏診;LAC 則多為「立即反應型(immediate-acting)」。
   • Mixing study 的判讀並無絕對共識,尤其在 aPTT 僅輕度延長且混合後矯正時,判讀較不明確,部分中心會選擇跳過 mixing study,直接針對臨床最可能病因進行特異性檢測。

2. PT 與 aPTT 同時延長時,鑑別診斷有哪些?

   • 共同路徑因子(X、V、II、fibrinogen)缺乏或抑制。
   • 多重凝血因子缺乏(如維生素 K 缺乏、warfarin 效應、肝病)。
   • 後天性 dysfibrinogenemia、DIC、LAC。
   • 標準流程(見 Figure 27-7):先做 thrombin time(TT)篩檢。TT 正常 → 做 PT、aPTT mixing study,依矯正與否分流至 LAC 檢測或 factor X、V、II 活性檢測。TT 延長 → 先排除抗凝血藥物干擾;若排除,則進行 fibrinogen 評估(clot-based fibrinogen、FDP、D-dimer、fibrinogen 抗原)。

3. 重度肝病造成的凝血病變與 DIC 最重要的鑑別特徵是什麼?

   • 進行性肝病會使肝臟合成的所有凝血因子下降,唯獨 factor VIII 不受影響甚至可能偏高(因 factor VIII 主要由血管內皮細胞而非肝細胞合成),這是與 DIC(factor VIII 通常也會消耗下降)鑑別的關鍵考點。

4. 外用牛源性凝血酶(topical bovine thrombin)產品為何可能導致出血?

   • 此類止血產品除 thrombin 外常也含有 bovine factor V。
   • 病人可能對牛源蛋白產生抗體,此抗體可能與人類 prothrombin 或 factor V 產生交叉反應(cross-react),導致後天性 factor V 或 prothrombin 抑制物,造成臨床出血。
   • 診斷依據:因子活性偏低,並證實有抑制物存在。

5. Lupus anticoagulant hypoprothrombinemia syndrome 的機轉與 mixing study 表現有何特殊之處?

   • 罕見的後天性 prothrombin 缺乏,合併 LAC,可能表現為異常出血。
   • 機轉特殊:此類自體抗體並非直接作用於 prothrombin 的活性位點,而是形成免疫複合體(immune complex),加速 prothrombin 的清除,導致 prothrombin 活性下降。
   • 因此在 mixing study 中不會表現出典型的抑制物型態(inhibitor pattern),是重要的觀念陷阱。低因子活性加上抑制物證據可確立診斷。

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十一、凝血因子活性與抑制物檢測(Factor Activity & Inhibitor/Bethesda Assays)

1. 凝血因子活性檢測(1-stage clotting assay)的基本原理為何?何時懷疑有抑制物存在?

   • 將已知濃度梯度的因子缺乏血漿(factor-deficient plasma)與 PNP 混合建立校正曲線(calibration curve),再以病人血漿加入因子缺乏血漿測得的 PT 或 aPTT 結果對照校正曲線,推算因子活性。
   • 至少需做 3 個系列稀釋(serial dilutions),結果經稀釋倍數校正後應得到相近的因子活性值。
   • 若不同稀釋倍數得到的活性值不一致(non-parallel to calibration curve),即提示可能存在抑制物;需進一步檢測以確認抑制物是「因子特異性(如 factor VIII 抑制物)」還是「非特異性(如 LAC)」。

2. 重組凝血因子產品(延長半衰期製劑)對 factor VIII/IX 活性檢測有何已知的實驗室陷阱?

   • 為延長半衰期,現行策略包括將 recombinant FVIII 或 FIX 融合 human immunoglobulin Fc 區域、白蛋白(albumin)或聚乙二醇化(PEGylation);更進一步的策略是將 VWF 的 D’D3 區段接於 FVIII-Fc(延長 FVIII 半衰期)。
   • 這些修飾產品可能在「1-stage clotting assay」與「chromogenic assay」之間出現活性結果不一致的情形,且此差異具藥物與試劑特異性(reagent-specific)。
   • 臨床意義:治療血友病病人時,醫師應了解所屬實驗室試劑對這些修飾產品的敏感度,並與檢驗團隊溝通討論此類差異;此差異亦見於部分輕度 hemophilia A 病人,且與特定 F8 突變相關。

3. Bethesda assay 的定義與臨床意義為何?

   • 用於定量 factor VIII 抑制物的效價,單位為 Bethesda units(BU)。
   • 定義:1 BU 為在 1:1 混合(病人血漿:正常血漿)後,使殘餘 factor VIII 活性降為 50% 所需的抑制物量。
   • Titer 0.5–5.0 BU/mL 為低效價(low titer),可嘗試以較大劑量 factor VIII 克服;titer >10 BU/mL 為高效價,須改用替代治療(如 recombinant porcine factor VIII、recombinant factor VIIa、activated prothrombin complex concentrate,或 factor VIII 模擬雙抗體 emicizumab)控制出血。

4. 使用 emicizumab 的病人如何監測其原本的 factor VIII 抑制物效價?

   • 須使用「以牛源蛋白(bovine-based proteins)為基礎的 chromogenic factor VIII assay」,因這類試劑不受 emicizumab 效應干擾,才能真實反映病人本身的抑制物濃度與 factor VIII 狀態。

5. 後天性血友病 A(acquired hemophilia A)的臨床與檢驗特徵、以及與先天性血友病抑制物的差異為何?

   • 無明顯出血病史的病人突發嚴重出血症狀,凝血檢查顯示 aPTT 延長,且在 1:1 mixing 後未能立即完全矯正,或於 37°C 培養 1–2 小時後延長更明顯(即抑制物延遲反應型態)。
   • 確診須發現極低或測不到的 factor VIII 活性。
   • 與先天性血友病 A 的抑制物相比,後天性抑制物在 Bethesda assay 中常呈現非典型動力學(atypical kinetics),且抑制物效價與臨床出血嚴重度的相關性較差。

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十二、Thrombin Time、Reptilase Time 與 Fibrinogen 檢測

1. Thrombin time(TT)測量什麼?哪些情況會使其延長?

   • TT 測量 thrombin 將可溶性 fibrinogen 轉為不溶性 fibrin 凝塊所需時間,繞過內源性、外源性及共同路徑,直接評估最終步驟。
   • 延長原因:UFH、LMWH、argatroban、bivalirudin、dabigatran 等抑制 thrombin 的藥物;低 fibrinogen 血症(通常 <約 90 mg/dL);dysfibrinogenemia;高濃度 fibrin degradation products;免疫球蛋白副蛋白(paraprotein)干擾 fibrin 聚合。
   • L-asparaginase 可經由抑制肝臟合成造成低 fibrinogen 血症。

2. Reptilase time 與 TT 有何不同?臨床上如何利用兩者鑑別診斷?

   • Reptilase(蛇毒酵素)只切割 fibrinopeptide A(相對地,thrombin 同時切割 fibrinopeptide A 與 B)。
   • Reptilase time 同樣會被低 fibrinogen 血症及多數 dysfibrinogenemia 延長,但不受 heparin 影響,因 reptilase 不被 antithrombin(AT)或 direct thrombin inhibitors 滅活。
   • 臨床應用:當 TT 延長但懷疑是 heparin 污染所致時,可加做 reptilase time 作鑑別——若 reptilase time 正常而 TT 延長,支持 heparin(或其他 thrombin inhibitor)效應;若兩者皆延長,則指向真正的 fibrinogen 異常。

3. Fibrinogen 活性(Clauss method)與 fibrinogen 抗原檢測的差異及臨床意義?

   • Clauss method 本質上是修飾版 TT,以 fibrinogen 為限速成分(thrombin 濃度刻意調高,以降低對 heparin 治療劑量的敏感性,但仍可能受 direct thrombin inhibitors 影響);凝固所需時間與 fibrinogen 活性成反比,結果以 mg/dL 表示。
   • Fibrinogen 抗原(免疫學方法)測量的是蛋白質「量」而非「功能」。
   • 若功能性檢測(活性)結果不成比例地低於抗原(量)結果,提示 dysfibrinogenemia(有量無功能);常規醫院 fibrinogen 檢測多指活性檢測。

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十三、整體止血功能檢測與床邊凝血檢測(Global Hemostasis & POC Testing)

1. Viscoelastic testing(TEG/ROTEM)測量的原理與臨床應用場景為何?

   • 原理:監測全血(whole blood)在旋轉杯中凝固、穩定與溶解過程中的黏彈性(viscoelastic properties)變化,經由機械-電力轉換器(TEG)或改良的共振技術(ROTEM/Quantra)產生凝塊堅實度隨時間變化的曲線。
   • 報告參數包含:凝塊開始形成時間、初始凝塊形成速率、最大凝塊堅實度,以及反映凝塊隨時間降解的溶解相關參數。
   • 特定型態可提示凝血病變、低纖維蛋白原血症、血小板低下、過度纖溶(hyperfibrinolysis)。
   • 主要臨床應用場景是肝臟移植、創傷與心肺繞道手術(cardiopulmonary bypass)等情境下,快速床邊指導輸血成分及凝血因子替代治療,在一般出血性疾病的「診斷」上效用有限(此為重要考點:viscoelastic test 不是用來診斷特定凝血因子缺乏)。

2. Activated clotting time(ACT)的用途及影響因子有哪些?

   • ACT 是心臟/血管介入及心肺繞道手術中管理未分流片段肝素(UFH)的主要監測工具,可測量遠超 aPTT 可偵測範圍的高劑量肝素效應(UFH >1 U/mL 時 aPTT 會無限延長,但 ACT 仍可反映劑量)。
   • ACT 依不同臨床情境(如低劑量的體外循環支持、高劑量的心臟手術)有各自的目標範圍。
   • 影響 ACT 的其他因素包括:血小板低下、血小板功能異常、血液稀釋、低纖維蛋白原血症、凝血因子缺乏、LAC、低體溫,這些都可能使 ACT 結果偏離單純反映肝素效應。

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十四、von Willebrand Disease 檢測與血小板功能檢測

1. 診斷 VWD 的初步實驗室篩檢應包含哪三項?

   • VWF 抗原(VWF:Ag)。
   • VWF 血小板結合活性的量測(如 VWF ristocetin cofactor,VWF:GPIbM activity)。
   • Factor VIII 活性。
   • (依此三項結果的比值與絕對值,可初步區分 quantitative:type 1、type 3 與 qualitative:type 2A、2B、2M、2N 的 VWD 亞型;後天性 von Willebrand syndrome[AVWS]則可經多種病理機轉導致相似的實驗室表現。)

2. 血小板功能檢測的整體策略為何?PFA-100/200 的原理與限制是什麼?

   • 評估流程:先確認自動分析儀所報告的血小板計數與體積、並檢視 Wright 染色抹片的血小板形態。
   • PFA-100/200:全血檢體流經塗有 collagen 及 epinephrine 或 ADP 的膜孔,模擬體內出血時間,測量阻塞膜孔所需時間,是初步(global)篩檢工具。
   • 敏感度:對嚴重血小板功能缺陷(如 Glanzmann thrombasthenia、Bernard-Soulier syndrome、嚴重 VWD)較敏感;但對輕至中度血小板功能疾病或 VWD 的敏感度有限。
   • 重要干擾因子:貧血(Hct <30%)及血小板低下(<100×10⁹/L)皆可使 closure time 假性延長,判讀時須排除這兩項混雜因子。

3. 血小板聚集試驗(aggregation study)為何仍被視為「金標準」,但臨床使用受限?

   • 雖被視為血小板功能檢測的金標準,但操作耗時、標準化程度差,對操作與檢體品質要求高。
   • 可搭配特殊試劑評估 dense granule ATP 釋放,協助指向特定診斷(如 Glanzmann thrombasthenia、aspirin-like defect)。
   • 其他選擇性檢測:flow cytometry(評估血小板膜受體,如 GPIIb/IIIa、GPIb)、electron microscopy(評估 dense granule 內容物或血小板細胞解剖構造),但這些檢測多僅在特定實驗室經驗證,對送檢檢體的穩定性(shipped samples)要求高。
   • 基因分析為評估多種先天性血小板數量或功能疾病的另一途徑。

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十五、篩檢正常卻仍有出血傾向的疾病(Bleeding Disorders with Normal Screening Tests)

1. PT、aPTT、血小板計數皆正常時,仍應考慮哪些造成延遲性出血的疾病?

   • Factor XIII 缺乏:factor XIIIa 負責 crosslink fibrin monomer 形成穩定凝塊,缺乏時初期凝血正常但凝塊不穩定,造成延遲性出血。篩檢用 urea clot solubility test,但僅在嚴重缺乏(factor XIII 活性 <5%)時才會呈異常,是敏感度極低的定性試驗;確診須以定量的 factor XIII 抗原及活性檢測。
   • 纖維蛋白溶解路徑缺陷(fibrinolytic pathway defects):如 plasminogen activator inhibitor 1(PAI-1)或 α₂-antiplasmin 缺乏,導致先天性過度纖溶(congenital hyperfibrinolysis)。

2. 後天性過度纖溶(acquired hyperfibrinolysis)常見於哪些情境?實驗室如何佐證「原發性纖溶」而非 DIC?

   • 常見情境:進行性肝硬化或肝臟移植(tPA 清除下降)、心肺繞道手術(內皮細胞釋放 tPA 增加)、amyloidosis、特定蛇毒咬傷(envenomation)、以及 DIC。
   • 支持原發性纖溶的實驗室證據:(1)因 plasmin 直接分解而導致 fibrinogen 明顯下降;(2)fibrin/fibrinogen degradation products 升高;(3)D-dimer 沒有顯著升高(因原發性纖溶並非以「已交聯的 fibrin 凝塊」分解為主),此為與 DIC 鑑別的關鍵。

3. DIC 的實驗室表現有何特點?ISTH 的評分系統表現如何?

   • 急性、失代償型 DIC 常見血小板計數與 fibrinogen 濃度偏低,或連續追蹤呈下降趨勢。
   • PT、aPTT、TT 可能因消耗程度不同而延長,D-dimer 則因失調的 thrombin 活性與續發性纖溶而顯著升高。
   • ISTH 發展的 DIC 評分系統納入血小板計數、fibrin degradation 標記、PT、fibrinogen 濃度;前瞻性研究顯示其敏感度達 93%,特異度可達 98%。

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十六、抗栓治療監測(Monitoring of Antithrombotic Therapy)

1. 各類抗栓藥物分別以哪些檢驗監測?為何 anti-Xa 常優於 aPTT 監測 UFH?
   • Warfarin(vitamin K antagonist):以 PT/INR 監測。
   • UFH:傳統以 aPTT 監測,但 chromogenic anti-Xa assay 或更 specific 的 anti-Xa 檢測更常被建議用來調整劑量。
   • Anti-Xa 監測 UFH 的優勢:(1)達到治療濃度所需時間較短;(2)結果變異性較低,較少因此調整劑量或增加檢測次數;(3)不受凝血因子缺乏、LAC、急性期反應物(acute phase reactants)干擾(這些都可能混淆 aPTT 結果)。
   • LMWH:以 anti-Xa 監測,尤其適用於腎功能不全或體重極端(過輕/過重)使劑量效應難以預測的病人。
   • DOAC:一般不需常規治療藥物監測;常規 INR/aPTT 對 DOAC 效應相對不敏感,在出血、突發性血栓、疑似不遵醫囑、體重極端、或需緊急手術/溶栓治療前等特殊情境,可用經特定藥物校正的 anti-Xa 或 anti-IIa(dilute TT)檢測評估藥物濃度。

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十七、後天性血小板低下的特殊檢測(Specialized Testing for Acquired Thrombocytopenia)

1. 一般血小板抗體檢測在免疫性血小板低下症的角色為何?

   • 免疫介導性血小板低下症目前仍主要是排除性臨床診斷,因偵測血小板特異性抗體的實驗室方法整體表現不佳。
   • 偵測總體或表面結合血小板免疫球蛋白(platelet-bound immunoglobulin)的檢測缺乏特異性,不建議常規使用。

2. Heparin-induced thrombocytopenia(HIT)及其相關病症檢測的核心標的是什麼?近年有哪些新興相關疾病?

   • 核心標的是針對 platelet factor 4(PF4)的抗體。
   • 相關的前凝血性臨床疾病包括:(1)典型 HIT;(2)vaccine-induced immune thrombocytopenia(VITT),與 adenovirus vector 基礎之 COVID-19 疫苗相關;(3)近期新描述的 anti-PF4 immunothrombosis(自發性、無肝素或疫苗暴露)。

3. TTP 與 HUS 在檢驗上如何鑑別?ADAMTS13 檢測的角色為何?

   • 微血管病變性溶血性貧血(MAHA)是各種 thrombotic microangiopathy(TMA)的共同實驗室特徵,但需與惡性高血壓、子癲前症、HELLP syndrome、抗磷脂症候群、敗血症等鑑別。
   • 嚴重 ADAMTS13 缺乏(活性通常 <10%)是 TTP 區別於其他 TMA 症候群的標誌性特徵;ADAMTS13 活性及自體免疫機轉標記物(如抑制物、抗體)在初診及追蹤時皆具重要意義。
   • ADAMTS13 基因分析可用於確診嚴重先天性 ADAMTS13 缺乏(先天性 TTP)。
   • 典型 HUS 常與 Shiga 毒素相關微生物感染有關,可透過偵測毒素相關免疫或基因標記輔助診斷。
   • 非典型 HUS(atypical HUS)通常與補體替代路徑調控失常有關,診斷相當困難,在某種程度上仍是排除性診斷。

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十八、血栓形成傾向檢測(Thrombophilia Assays)

1. 先天性(遺傳性)血栓形成傾向的檢測項目主要有哪些?

   • 定量或定性的 antithrombin、protein C、protein S 缺乏。
   • 功能增強型(gain-of-function)突變:factor V Leiden(即 activated protein C resistance 的分子基礎)及 prothrombin gene mutation(prothrombin G20210A)。

2. 抗磷脂症候群(antiphospholipid syndrome)的診斷需要哪些條件?

   • 需同時具備臨床表現(如血栓事件或特定產科併發症)加上持續陽性(通常需間隔至少 12 週兩次以上檢測)之下列任一或多項標記:lupus anticoagulant、anticardiolipin antibody、或 anti-β₂-glycoprotein I antibody。
   • 美國血液學會(ASH)已針對 antiphospholipid syndrome 發布相關指引。

3. 血栓形成傾向篩檢的時機與病人選擇有哪些重要考量?

   • 通常於病人發生靜脈血栓栓塞(VTE)事件且無明顯後天性危險因子時才考慮檢測。
   • 是否檢測及檢測時機須考慮病人性別、年齡、血栓病史、家族史,以及檢測結果是否會實際影響抗凝血藥物的選擇或療程長短——若結果不會改變治療決策,則不建議常規檢測。

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本筆記依據 ASH-SAP 9th ed.(2025)第27章「Laboratory hematology」(pp. 301–321)改寫,Bibliography 未逐條轉換,讀者如需原始文獻請查閱原書。